0 引言 Introduction

膝骨关节炎是一种以关节软骨损伤、关节周围骨赘生成和滑膜炎症等为特征的膝关节退行性疾病[1]，在中医属“骨痹”“膝痹”等范畴，其在临床上多表现为膝关节疼痛、屈伸活动受限，甚则时常出现局部肿胀、关节腔积液等。随着病情的进展，这些症状会增加老年患者步行时跌倒的风险[2]，甚至会逐步导致患者步行能力的丧失，给患者带来极大的危害。

当前临床使用较多的用于控制膝骨关节炎炎症和疼痛等症状的药物(如NSAIDS 等)多具有胃肠道损害等慢性毒副作用，因此具有更小不良反应并且可能治疗膝骨关节炎的中草药得到越来越多的关注。姜是中国及印尼传统医药中广泛使用的药食同源的一种药材，在祛风除痹的治疗作用上具有很大潜力，口服和涂抹姜的提取物可以减轻膝骨关节炎患者膝关节疼痛[3-5]。分子生物学研究显示，生姜中的活性成分可能通过HO-1 途径抑制诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶2 的表达保护软骨并在膝骨关节炎大鼠模型中发挥抗炎止痛的效果[6]。近年来也有报道联合使用姜提取物降低血清促炎细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α 等水平与膝骨关节炎中软骨损伤的减轻有关。例如ABDEL-RAHMAN等[7]发现姜黄和生姜提取物联合治疗可有效缓解膝骨关节炎大鼠模型的炎症免疫应答，减轻关节的病理损伤，并降低血清白细胞介素6，肿瘤坏死因子α 和Ⅱ型胶原C-端肽(CTX-Ⅱ)的水平，表现出软骨保护作用。红姜是生姜的一种变种，主要产于印度尼西亚、马来西亚和中国四川等地，富含的6-姜酚等成分具有一定的抗炎活性[8-9]，但是红姜提取物能否很好发挥抗炎特性，从而保护软骨、延缓早期膝骨关节炎的进展的报道较少。

当前早期膝骨关节炎的动物模型研究中，选用大鼠在其膝关节腔注射木瓜蛋白酶已成为一种经典的研究方法，这种方法具有周期短、成功率高的优点[10]。故此次研究通过膝关节腔注射木瓜蛋白酶建立早期膝骨关节炎大鼠模型，通过不同剂量的红姜提取物灌胃，观察干预后大鼠的软骨组织病理切片及血清中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α 和软骨中Col2α1 mRNA 表达的情况，探讨以姜保护软骨、延缓早期膝骨关节炎进展的可能的作用机制。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机分组对照动物实验，多组间均数比较采用单因素方差分析。

1.2 时间及地点实验于2020 年6 月至9 月在广州中医药大学实验动物中心及岭南医学中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 购置并饲养于广州中医药大学实验动物中心的SPF 级健康雄性SD 大鼠50 只，体质量180-220 g，动物生产许可证号：SCXK(粤)2018-0034。所有大鼠饲养于SPF级标准环境下，自由进食饮水。

1.3.2 实验主要药品及试剂 红姜(Zingiber officinale Roscoe var rubrum)产自印度尼西亚，由广东中医药博物馆中药标本中心主任冼建春教授鉴定为正品。参照陈婷等[11]的方法，将5 kg 干净的红姜切碎后浸于5 L 的体积分数95%乙醇中，振荡、加热、悬蒸，得到红姜提取物；高效液相色谱分析法(HPLC)鉴定所得红姜提取物中姜辣素含量为5.58%，6-姜酚含量为2.18%。塞来昔布胶囊(美国辉瑞制药有限公司，国药准字J)；水合氯醛(C，Macklin)；木瓜蛋白酶(1364GR005，BioFroxx)；白细胞介素1β ELISA 试剂盒、白细胞介素6 ELISA 试剂盒、肿瘤坏死因子α ELISA 试剂盒(均为R&D system)；反转录试剂盒(DBI-2220，DBI) ；荧光定量PCR试 剂 盒 ( AOPR-1200，Genecopies)；无RNase 水 (V，Vetec)。

1.3.3 实验主要设备 多功能酶标仪(上海现科)；电子分析天平(梅特勒-托利多)；纯水仪(重庆艾科浦)；正置显微镜(Olympus)；CFX96 Optic Module 型实时荧光定量PCR 仪(美国Bio-Rad)；RM2245 半自动轮式石蜡切片机(德国莱卡)；旋转蒸发仪(广州艾卡)；LC-30AD 高效液相色谱仪(日本岛津)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模与分组 实验前适应性喂养7 d，随后从50只SPF 级SD 雄性大鼠中随机抽取10 只作为空白组，其余40只大鼠建造膝骨关节炎模型，造模过程无大鼠死亡。

造模方法：麻醉药物选择10%的水合氯醛溶液，抓取大鼠以3 mL/kg 剂量对其腹腔注射。待大鼠充分麻醉后，将大鼠膝关节待注射处毛发剃净，棉签蘸取体积分数75%的乙醇消毒，然后屈曲大鼠膝关节至45°左右，以髌韧带胫骨附着点外上方约1 mm 处为进针点，然后抽取4%木瓜蛋白酶0.2 mL+0.03 mol/L 的L-半胱氨酸混合溶液，经皮肤刺入有落空感即表明针头到达关节腔内，随即进行注射，注射完毕退出针头后，使用棉签压迫针口以防出血，另一膝关节采用同样方法完成木瓜蛋白酶注射，所有注射完成后给予20 万U青霉素钠肌注以防大鼠感染。每隔3 d(即第1，4，7 天)进行1 次上述造模操作，共3 次。

文章来源：《动物学杂志》 网址: http://www.dwxzzzz.cn/qikandaodu/2021/0611/627.html

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